S.E Mons. Ambrogio Spreafico, è nato a Garbagnate Monastero (Lecco), nella Arcidiocesi di Milano, il 26 marzo 1950 da Luigi e da Maria Molteni. Ha ricevuto la formazione al sacerdozio nei Seminari della Congregazione dei Chierici Regolari di San Paolo (Barnabiti), dove ha percorso il curriculum studiorum dalla scuola media fino al liceo classico. 

Il 12 aprile 1975 è stato ordinato Sacerdote. Si è incardinato successivamente nella diocesi di Roma. Ha ottenuto il baccalaureato in Filosofia e Teologia presso la Pontificia Università Urbaniana, proseguendo gli studi per la specializzazione in Sacra Scrittura presso il Pontificio Istituto Biblico di Roma, dove nel 1978 ha conseguito la Licenza e nel 1984 il Dottorato. 

Ha ricoperto i seguenti incarichi: 

• dal 1978 al 1986 docente di Antico Testamento presso l’ISSR della Pontificia Università Gregoriana; 
• Docente di lingua ebraica al Pontificio Istituto Biblico di Roma (1978-1991); 
• docente di lingua ebraica presso la facoltà Valdese di Teologia negli anni 1984-85;
• dal 1992 al 2008 Docente di Antico Testamento alla Facoltà Teologica della Pontificia Università Urbaniana; 
• Rettore Magnifico della medesima Università per tre mandati (1997-2000; 2001-2003; 2005-2008); 
• Presidente della Conferenza dei Rettori delle Università Pontificie Romane (2000-2003) e Consultore della Congregazione per l’Evangelizzazione dei Popoli (1998-2008). 

È autore di numerose pubblicazioni ed articoli di carattere biblico e spirituale su diverse riviste e dizionari specializzati. Tra le lingue moderne conosce e parla tedesco, inglese e francese, legge e comprende lo spagnolo e il portoghese. Ha svolto la sua attività pastorale nella comunità di Sant’Egidio a Roma e in Germania, e nella parrocchia di Santa Maria in Trastevere e di San Filippo Neri alla Garbatella in Roma. Il 10 aprile 1998 è stato nominato Cappellano di Sua Santità. 

Il 3 luglio 2008 è stato eletto vescovo coadiutore di Frosinone – Veroli – Ferentino e consacrato Vescovo nella Arcibasilica Lateranense il 26 luglio 2008 dal card. Tarcisio Bertone, Segretario di Stato di Sua Santità. Il 28 luglio 2008 ha iniziato il suo ministero diocesano. Il 18 ottobre 2008 è divenuto Vescovo della Diocesi. Dal maggio 2010 al giugno 2015 è stato Presidente della Commissione Episcopale della Conferenza Episcopale Italiana per l’Evangelizzazione dei Popoli e la Cooperazione tra le Chiese. Dal 4 maggio 2011 è stato nominato dal Santo Padre membro della Congregazione delle Cause dei Santi. Il 18 maggio 2016 è stato eletto Presidente della Commissione Episcopale per l’ecumenismo e il dialogo interreligioso, della quale era già presidente “ad interim” dal gennaio 2016. 

L’8 luglio 2020 è stato nominato dal Santo Padre membro del Pontificio Consiglio per il Dialogo Interreligioso. Dal 14 giugno 2021 è stato nominato Presidente della Commissione Regionale per l’Ecumenismo e il Dialogo Interreligioso (per il quinquennio 2021-2025). 

In data 10 novembre 2022 il Santo Padre lo ha nominato Vescovo della Diocesi di Anagni-Alatri, unendo le due sedi in persona Episcopi. Il 18 febbraio 2023 è stato nominato dal Santo Padre membro del Dicastero per la Cultura e l’Educazione.